ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 33127—2016 甘蔗线条病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Sugarcane streak virus 2016-10-13发布 2017-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T33127—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 疫局。 本标准主要起草人：冯黎霞、武目涛、刘福秀、赵立荣、王卫芳、杨雷亮。 I GB/T33127—2016 甘蔗线条病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了甘蔗线条病毒的检疫鉴定方法 本标准适用于可能带有甘蔗线条病毒的活体寄主植物的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 3甘蔗线条病毒基本信息 3 中文名：甘煎线条病毒。 学名：Sugarcane streak virus。 缩写：SSV。 分类地位：双生病毒科（Geminiviridae），玉米线条病毒属（Mastrevirus）。 甘蔗线条病毒的其他信息参见附录A。 4方法原理 SSV的免疫原性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。利用常规PCR、实时荧光PCR、双抗体 夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA)和免疫电镜方法对样品进行检测。 仪器设备、设施、用具和试剂 5.1仪器 电子天平（感量0.001g）、高速离心机、小型瞬时离心机、超低温冰箱（一80℃）、制冰机、涡旋振荡 器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、透射电子显微镜、超净工作台、PCR仪、实时荧光定量PCR仪、微 波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪、酶联检测仪。 5.2设施 隔离温室（10℃～30℃）。 5.3用具 酶联板、可调移液器（2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000μL)和可调移液器头、离心管、研钵、微型 1 GB/T33127—2016 磨杵等。 5.4试剂 除有特别说明外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。DAS-ELISA测 定试剂见附录B;PCR检测试剂见附录C实时荧光PCR检测试剂见附录D。 6症状观察与抽样 6.1症状观察 现场检疫主要观察植物材料上病毒为害的症状，SSV为害症状描述参见附录A。 6.2抽样 发现有病毒为害症状的植物材料直接送检；未发现症状的，则按SN/T2122中规定进行抽样，并送 实验室检测鉴定。 7实验室检测 7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA） 对待检组织进行研磨，并按1：10（质量：体积）的比例加人抽提缓冲液，制备的汁液分别盛装于离 心管中，离心后吸取上清液作为待测样品，并设阳性对照、阴性对照和空白对照。具体操作步骤见附 录B。 7.2常规 PCR检测 植株叶片液氮研细，取0.1g用于提取植物总DNA，双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的 DNA后进行常规PCR检测，具体操作步骤见附录C。 7.3 实时荧光PCR检测 实时荧光PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1，双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的 DNA后进行实时荧光PCR检测，具体操作见附录D。 7.4免疫电镜检测 按照SN/T1840中规定的方法制备样品和进行电镜观察病毒粒子形态。在免疫电镜下如观察到 大小为30nm×20nm的杆状双联体粒体，即可判定结果阳性。 8结果判定 样品检测时，检测结果判定按下述原则进行： 样品经PCR检测为阴性；或者样品经PCR检测为阳性，但是序列测定结果与目的序列不一 致，则判定样品不携带甘蔗线条病毒。 样品经PCR检测为阳性，且序列测定结果为目的序列；同时免疫电镜、DAS-ELISA、荧光PCR 这三种检测方法其中一种为阳性检测结果，即可判定样品携带甘蔗线条病毒、