ICS 65.020.30 B 43 备案号：60856-2018 青 海 DB 63 省 地 方 标 准 DB 63/T 1692—2018 八眉猪细管冻精生产技术规程 2018 - 09 - 25 发布 青海省质量技术监督局 2018 - 12 - 01 实施 发 布 DB 63/T 1692—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由青海省农牧厅提出并归口。 本标准起草单位：青海省家畜改良中心。 本标准主要起草人：马元梅、张楠、冯宇诚、张晋青、常永梅、赵春川、王芳、郭占泽、赵青山、 许发芳、莫常山、王朝风、何得仓、李景、刘于刚。 I DB 63/T 1692—2018 八眉猪细管冻精生产技术规程 1 范围 本规程规定了种公猪的选择和调教、采精前准备、采精、精液处理、精液冷冻、细管冻精解冻和镜 检、包装、标记和贮存、细管冻精质量评价等内容。 本规程适用于八眉猪细管冻精的生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4143 牛冷冻精液 GB/T 5458 液氮生物容器 NY/T 2823 八眉猪 3 种公猪的选择和调教 3.1 种公猪的选择 种公猪应符合NY/T 2823要求，三代系谱清楚。 3.2 种公猪的饲养管理 种公猪单圈饲养。定时定量饲喂，以精料为主，满足其营养需要，消化能需要量为28.45 MJ，体重 90 kg以下的公猪粗蛋白需要量为14%，90 kg以上为12%，每千克饲料含维生素A 3531 IU，维生素E 11 IU。 供给充足清洁饮水。经常刷拭猪体，保持清洁。每天适度运动1 h~2 h。 3.3 种公猪的调教 选择发情旺盛的母猪并固定，引诱公猪爬跨，待其爬上母猪后，将公猪阴茎导入空拳内进行采精， 反复训练2 次~3 次。 4 采精前准备 4.1 器械 4.1.1 仪器设备 37 ℃恒温箱、17 ℃车载恒温箱、水浴锅、移液枪、密度仪、显微镜、离心机、冰箱、低温柜、细 管封装一体机、程控冷冻仪、液氮生物容器、干燥箱。 4.1.2 器具 1 DB 63/T 1692—2018 保温集精杯、过滤膜、比色皿、锥形瓶、载玻片、盖玻片、离心管、烧杯、量筒、0.25 ml细管、 提筒、试管、细管剪。 4.2 器械的清洗 4.2.1 仪器设备的清洗和消毒 各仪器设备应定期用紫外灯照射消毒。使用结束后，应用洁净、柔软的布将残留的精液、水、污物 擦拭干净。 4.2.2 器具的清洗和消毒 各器具使用后浸泡在自来水中。洗涤时，先在加有洗涤剂的温热水中刷拭，然后用清水反复冲洗干 净，最后用蒸馏水冲洗。载玻片和盖玻片洗净后用柔软的布擦干备用，其他玻璃器皿将水晾干后放入干 燥箱，加热至160 ℃恒温60 min，自然冷却后待用。0.25 ml细管应置于紫外灯下消毒，其他非玻璃材 质的器具洗净后自然晾干，用75 %酒精棉球擦拭消毒。 4.3 采精场所的卫生和消毒 采精场所保持安静，地面保持清洁卫生，采精前应喷洒0.1 %高锰酸钾进行消毒。 4.4 稀释液配制 4.4.1 常温保存稀释液配制 向锥形瓶中加入1000 ml双蒸水，分别称取葡萄糖37 g、乙二胺四乙酸1.25 g、二水柠檬酸钠0.6 g、 碳酸氢钠1.25 g、氯化钾0.075 g，溶解于双蒸水中，搅拌均匀，用定性滤纸过滤至另一锥形瓶中，滤 液煮沸15 min，待温度降至常温，称取青霉素钠0.6 g、硫酸链霉素1 g加入滤液中并混匀。 4.4.2 冷冻基础液配制 向锥形瓶中加入1000 ml双蒸水，分别称取葡萄糖11 g、柠檬酸14.8 g、三羟甲基氨基甲烷24.2 g， 溶解于双蒸水中，搅拌均匀，用定性滤纸过滤至另一锥形瓶中，滤液煮沸15 min，待温度降至常温，称 取青霉素钠0.6 g、硫酸链霉素1 g加入滤液中并混匀。 4.4.3 冷冻稀释液 I 液配制 向锥形瓶中加入800 ml冷冻基础液、200 ml新鲜卵黄，搅拌均匀，置于17 ℃备用。 4.4.4 冷冻稀释液 II 液配制 向锥形瓶中加入940 ml冷冻稀释液I液、60 ml甘油，搅拌均匀，置于5 ℃备用。 4.4.5 解冻液配制 向锥形瓶中加入1000 ml双蒸水，分别称取葡萄糖50 g、二水柠檬酸钠3 g、乙二胺四乙酸1 g，溶 解于双蒸水中，搅拌均匀，用定性滤纸过滤至另一锥形瓶中，滤液煮沸15 min，待温度降至常温。 5 采精 5.1 台猪和种公猪的准备 2 DB 63/T 1692—2018 选择健壮、大小适中、性情温顺的母猪做台猪。采精前用清水冲洗台猪的外阴、臀部和公猪阴茎、 包皮及其周围腹壁，然后用0.01 %高锰酸钾溶液对公猪被清洗过的部位消毒，再用温水冲洗干净。 5.2 采精频率 后备种公猪每周采精一次，成年种公猪每周可采精两次。 5.3 采精方法 从37 ℃恒温箱中取出保温集精杯，杯口覆盖过滤膜。采精员戴乳胶手套，蹲在台猪的一侧，诱导 公猪爬跨台猪，按摩公猪睾丸，待公猪阴茎伸出后导入空拳内并握紧，当阴茎充分勃起后顺势向前牵拉， 手指有弹性并具有节奏的松握，引起公猪射精。另一手持保温集精杯采集中段精液，弃去前、后段精液。 取下过滤膜，盖保温盖。 6 精液处理 6.1 准备 凡接触精液的器皿均放在37 ℃恒温箱内，装有常温保存稀释液的锥形瓶置于37 ℃水浴锅待常温保 存稀释液温度升至37 ℃。 6.2 原精质量要求 6.2.1 原精外观要求 精液为乳白色，无皮毛等异物，略带腥味。 6.2.2 体积 将精液倒入量杯内直读精液体积。精液体积≥100 ml。 6.2.3 密度测定 用移液枪吸取3960 l生理盐水于比色皿中，再吸取40 l精液，同生理盐水混合均匀，用密度测 8 定仪测定精子密度。每毫升精液精子密度≥1 ×10 个。 6.2.4 精子活力和畸形率 取一小滴精液于载玻片，加盖盖玻片在带有38 ℃恒温装置的显微镜下检查精子活力和畸形率。精 子活力≥60%，精子畸形率≤15%。 6.3 精液常温稀释 用37 ℃常温保存稀释液按1︰1的比例等温稀释精液，将混合液放入17 ℃恒温箱待其温度降至17 ℃，并于72 h内完成冻精。 6.4 精液离心和上清液体积测定 将常温稀释后的混合液倒入50 ml离心管中，在17 ℃、重力800 g的条件下离心12 min，吸取上清 液于量筒，直读体积。 6.5 冷冻稀释液添加量计算 3 DB 63/T 1692—2018 6.5.1 最终精子总数计算 离心后精子总数按式（1）计算： n    v1 ........................................ (1) 式中： n—最终精子总数，单位为个； ρ—每毫升精液精子密度，单位为个； v1—精液体积，单位为毫升（ml）。 6.5.2 精子体积计算 离心后沉淀精子体积按式（2）计算： v  v1  v 2 ....................................... (2) 式中： v—精子体积，单位为毫升（ml）； v1—精液体积，单位为毫升（ml）； v2—上清液体积，单位为毫升（ml）。 6.5.3 最终精液总量计算 8 保证最终每毫升精液中精子密度≥3×10 个，最终稀释后精液总量按式（3）计算： s  n  3 ........................................ (3) 式中： s—最终精液总量，单位为毫升（ml）； n—最终精子总数，单位为个。 6.5.4 冷冻稀释液添加量计算 冷冻稀释液I液和II液添加量按式（4）计算： a1  a 2  sv ..................................... (4) 2 式中： a1—冷冻稀释液I液添加量，单位为毫升（ml）； a2—冷冻稀释液II液添加量，单位为毫升（ml）； s—最终精液总量，单位为毫升（ml）； v—精子体积，单位为毫升（ml）。 6.5.5 精液低温稀释 用17 ℃的冷冻稀释液I液等温稀释6.3中温度降至17 ℃的混合液；将装有稀释后精液的锥形瓶置于 装有17 ℃水的烧杯中，放入5 ℃冰箱平衡2 h。用5 ℃的冷冻稀释液II液等温稀释,经平衡、温度降至5 ℃的精液。冷冻稀释液I液和II液添加量按照6.5.4计算。 7 精液冷冻 4 DB 63/T 1692—2018 7.1 细管封装 7.1.1 细管要求 细管为无毒、耐低温的专用塑料管，0.25 ml剂型，保证清洁、无菌。 7.1.2 封装 在4 ℃低温柜中采用细管封装一体机通过计算机程序控制，进行灌装、封口、打印标识。 7.1.3 细管标识 细管标识清晰，信息齐全，包括冻精产地、品种、冻精生产日期、猪号。 7.2 上架 封装后的细管整齐的码放在专用细管架上。 7.3 冷冻 采用程控冷冻仪冷冻， 按照预先设定的最佳冷冻曲线自动完成冷冻。最佳冷冻曲线降温速率为：4 ℃ ~1 ℃（降温速率2 ℃/ min），共1 min 30 s；1 ℃~ -25 ℃（降温速率30 ℃/min），共2 min 24 s； -25 ℃~ -140 ℃（降温速率30 ℃/ min），共6 min 12 s；-140 ℃保持30 s。 7.4 细管冻精收集 冷冻完成后，按猪号取出细管冻精投入盛满液氮的提筒中，细管的超声波封口端在上，棉塞端在下， 并迅速浸入液氮中。 8 细管冻精解冻和镜检 8.1 细管冻精解冻 预先将水浴锅温度调至38 ℃，将解冻液加入试管，并浸泡在38 ℃水浴锅中预热。用长柄镊子取一 支细管冻精迅速浸入38 ℃水浴锅中晃动，待溶解后立即取出，用吸水纸或纱布擦干水珠，再用细管剪 剪去超声波封口端，用推针将精液注入预先升温至38 ℃的试管中，用38 ℃解冻液按精液与解冻液1：3 的比例进行稀释。 8.2 活力检测 方法见本标准的6.2.4。活力≥30%的细管冻精作为初检合格品妥善贮存。 9 包装、标记和贮存 9.1 包装 用无菌纱布袋包装，包装应在-140 ℃以下环境中进行。 9.2 标记 包装袋外应进行明显标记。注明公猪号、生产日期、数量、精子活力。 5 DB 63/T 1692—2018 9.3 贮存 用液氮生物容器贮存细管冻精，液氮生物容器符合GB/T 5458要求。设专人保管，每周定时加一次 液氮，液氮应浸没冻精。应经常检查液氮生物容器的状况，如发现容器外壳结白霜，立即将细管冻精转 移到其他液氮生物容器内保存。取放细管冻精时，提筒在容器颈下，冻精离开液氮的时间不得超过5 s。 取放之后，及时盖好容器塞。 10 细管冻